Proiect VIASAN 196

Proiect VIASAN 196 (2003-2005): Model celular de studiu al patogenezei fibrozei pulmonare

Coordonator: Universitatea din Bucureşti

Director proiect: prof. dr. Dana Iordăchescu

Membrii echipei: prof. dr. Otilia Zărnescu, lect. dr. Anişoara Cîmpean; doctoranzi cu frecvenţă: Adela Bonoiu, Gabriela Bucată, Raluca Ciubăr, Laura Homeghiu, Cristina Iancu, Cristina Stan; student master: Valentina Mitran

Parteneri: Spitalul Universitar de Urgenţã  Bucureşti, Laboratorul clinic de anatomie patologică (conf. dr. Maria Sajin)

Proiectul se încadrează în obiectivele generale ale programului VIASAN de promovare şi susţinere a cercetărilor multidisciplinare, în vederea înţelegerii mecanismelor îmbolnavirii la om şi în tratarea afecţiunilor patologice cu impact mare în populaţie, în contextul modern actual, în vederea eliminării decalajului existent la nivelul european,  de dinamizare a aplicării şi diseminării rezultatelor cercetării bio-medicale româneşti.

De asemenea, proiectul se încadrează în obiectivele specifice ale programului VIASAN privind studiul unor procese celulare în biologie şi patologie, ale Subprogramului 3  «Medicina moleculară şi celulară», deoarece patogeneza fibrozei pulmonare este necunoscută, iar  tratamentul actual este nedirecţionat şi infecient. Proiectul se bazează pe ipoteza că evenimentul primar în fibroza pulmonară este lezarea /activarea celulelor epiteliale alveolare care sintetizează o varietate de citokine şi factori de creştere implicaţi în migrarea, proliferarea, modificarea fenotipului fibroblastelor, în remodelarea matricei extracelulare şi apoi de distrugerea arhitecturii pulmonare - elemente cheie în transformarea unui proces reversibil într-unul progresiv şi ireversibil. În patogeneza fibrozei pulmonare pot fi implicate şi speciile reactive ale oxigenului (SRO), mai ales în maladiile profesionale, care apar ca urmare a inhalării unor particule metalice, cunoscută fiind relaţia dintre căile de semnalizare ale SRO şi ale citokinelor pro-fibrogenice.

Modelul celular de studiu al fibrozei pulmonare s-a realizat prin studiul comparativ al rezultatelor tratamentelor fibroblastelor pulmonare normale cu TGF-b1 sau/şi clorură de cadmiu. TGF-b1 este un mediator pro-fibrotic cheie,  un agent chemotactic pentru fibroblaste ce promovează transformarea lor în miofibroblaste (celule ale ţesutului conjunctiv care cresc în muşchi şi pot produce fibroza), care induce sinteza proteinelor matricei extracelulare şi inhibă degradarea colagenului prin inducţia inhibitorilor TIMP şi reducerea nivelului metaloproteinazelor matriceale. Cadmiu (Cd2+)  este un metal greu larg răspândit în mediu, deosebit de toxic  pentru om, fiind implicat în patogeneza unor maladii profesionale, în dezvoltarea emfizemului şi a fibrozei pulmonare. Toxicitatea Cd2+ implică mecanisme oxidative deoarece terapia antioxidantă o diminuează.

Obiectivele concrete ale proiectului:

• Studiul comparativ al fibroblastelor pulmonare umane izolate din regiuni cu focare fibrotice şi din ţesut pulmonar normal;
• Elaborarea unui model celular ce reproduce modificările morfologice şi biochimice ale fibroblastelor în fibroza pulmonară;
• Verificarea modelului celular prin studii comparative de biochimie, biologie celulară şi moleculară pe fibroblaste pulmonare normale, izolate din focare fibrotice şi din modelul celular cu fibroză pulmonară indusă experimental;
• Studiul acţiunii unor compuşi cu activitate anti-fibrotică asupra modelului celular

Activităţi pentru realizarea obiectivelor proiectului:

• Selectarea anatomo-patologică a biopsiilor şi pieselor chirurgicale;
• Caracterizarea histologică a pieselor anatomice din care se separă culturi de fibroblaste;
• Obţinerea de culturi celulare;
• Studii de fenotip celular, viabilitate, proliferare, citotoxicitate;
• Tratamentul celulelor cu TGF-b /+ CdCl2;
• Studiul stresului oxidativ;
• Evaluarea citokinelor proinflamatorii eliberate în mediu;
• Studiul expresiei şi activităţii unor metaloproteinaze matriceale;
• Studiul acţiunii KGF (keratinocyte growth factor).

Baza materială:

• Laborator de culturi de celule animale cu arii sterile (hotă cu flux laminar, incubator cu CO2, microscop cu inversie + sistem de fotodocumentare + sistem de epifluorescenţă, centrifugă cu răcire şi microcentrifugă, balanţă, vortex),
• Laborator de prelucrarea materialelor (sisteme de sterilizare umedă şi uscată, balanţe), Staţie de purificare a apei (echipament de obţinere de apă ultra-purã Milli Q Synthesis),
• Laborator de conservare a celulelor (deep freezer la –96oC, recipiente cu azot lichid) şi cameră frigorifică,
• Laborator de Biochimie (spectrofotometre UV/VIS, spectrofluorimetru, centrifugă cu răcire, aparate de electroforeză şi western-blot, UV/VIS transiluminator, băi termostat, balanţe analitice, agitatoare) şi BCUM de Biologie Moleculară (sistem de multidetecţie pe microplăci TECAN, Densitometru de imagine computerizat, spectrofotometru).